Lo Studio sul Cheratocono

a cura del  Dott. Cosimo Mazzotta 

Il Dott. Mazzotta ha contribuito con i suoi studi di Microsocopia in vivo nell'uomo, alla validazione dell'intera procedura. Gli studi di microsocopia confocale in vivo condotti dal Dott. Mazzotta sono stati i primi a livello mondiale su questa tecnica e rappresentano il primum movens della fiducia e diffusione della metodica in tutto il Mondo, inclusi gli USA dove recentemente è partito lo studio della FDA. "Il libro sul Cheratocono" Clicca per ingrandire Pubblicazione del Dott. Mazzotta  "Haze cross linking CEO" Clicca per ingrandire Pubblicazione del Dott. Mazzotta "on Keratoconus jcrs 5475" Clicca per ingrandire  Analisi micromorfologica in vivo della cornea cross-linkata mediante microscopia confocale a scansione laser: primo studio internazionale   Il Cheratocono è una malattia degenerativa “ectasica” non infiammatoria della cornea ad esor- dio generalmente puberale, progressivo nel 20 % dei casi potenzialmentecandidabili a chirur- gia, con incidenza riferita in letteratura di circa 1/2000 casi nella popolazione generale. I valori di incidenza appaiono però significativamente sottostimati alla luce della diffusione delle attuali indagini Topo-Tomografiche e Pachimetriche. Alterazioni a carico della struttura del colla-gene corneale, della sua organizzazione, della sostanza intercellulare nonché l’apoptos e la ne-crosi cheratocitaria con alterazioni prevalenti o esclusive a carico dello stroma anteriore-centra- le e nella lamina di Bowmann sono state ampiamente documentate in letteratura tutto questo insieme rende ragione di una cornea “indebolita” soprattutto nellacomponente “strutturale” bio-meccanica. La metodica del cross-linking del collagene corneale consiste nella foto-polimerizza-zione delle fibre stromali per aumentarne la rigidità e la resistenza alla “cherato-ectasia”  attra-verso l’azione combinata di una sostanza fotosensibilizzante (riboflavina - vitamna B2) con l’irraggiamento mediante luce ultravioletta da illuminatore in stato solido di tipo UVA, oggi deno-minato Siena C.B.M. (Caporossi, Baiocchi Mazzotta) X-Linker C.S.O. - C.E. approved. Fin dall’inizio degli anni 90’ furono effettuati i primi studi di  fotobiologia per cercare di  individu- are “collanti biologici” attivabili con sorgenti termiche o luminose in grado di incrementare la re-sistenza del collagene stromale9 giungendo alla comprensione che l’azione collante era media- ta da un meccanismo ossidativo indotto dalla liberazione di radicali ossidrilici (ROS: Reactiv Oxi-gen Species). Meccanismo analogo di indurimento ed ispessimento delle fibre collagene è stato dimostrato nell’invecchiamento corneale10 legato ad un ruolo attivo della glicosilazione delle mo-lecole di tropocollagene età-dipendente. Le proprietà biomeccaniche della cornea dipendono for-temente dalle caratteristiche delle fibre collagene (15.000 km), dai legami  interfibrillari e dalla loro disposizione spazio-strutturale. La resistenza biomeccanica della cornea nel cheratocono è ridotta del 50% (Andreasson, Meek).La tecnica del cross-linking del collagene corneale viene impiegata ad oggi sperimentalmente (Dresda - Zurigo - Siena) per bloccare  almeno  pro-tem-pore (circa 3 anni i tempi medi di rinnovo delle fibrille collagene), la progressione della cherato-ectasia correlata al cheratocono in fase refrattiva come una sorta di “freezing” del collagene stromale con conseguente incremento della stabilità biomeccanica della cornea. Lo studio pilota di Wollensak e Coll ha avuto inizio a Dresda nel 1998 con risultati molto  incora-ggianti, tanto da consentire l’estensione dello studio  sull’uomo anche in Italia per la prima volta presso il Dipartimento di Scienze Oftalmologiche dell’Università di Siena, dove abbiamo effettua- to per la prima volta a livello internazionale i test di  validazione degli studi pre-clinici (effettuati su bulbi animali porcini e di coniglio)  ed umani enucleati mediante microscopia confocale a sca-nsione laser HRT II (Rostock Cornea Module) direttamente in vivo nell’uomo. Dopo unanime approvazione della ricerca “Siena Eye Cross Project 2004”13 da parte del Comi- tato Etico locale, in accordo   con i principi della dichiarazione di Helsinky, abbiamo  effettuato il trattamento di “cross-linking   corneale Riboflavina-UVA” su 44 pazienti affetti da cheratocono in stadio II in evoluzione (studio prospettico non randomizzato di fase 2 in aperto) in day surgery, in asepsi ed in anestesia   topica (lidocaina 4% coll.) per una durata complessiva di 30 minuti d’ irradiazione. Dopo l’applicazione del blefarostato abbiamo impiegato un marcatore da 9 mm di diametro e proceduto all’asportazione dell’epitelio corneale nei 9 mm centrali mediante scarifi-catore smusso o “mazza da golf” analogamente ad una PRK. L’instillazione della soluzione fotosensibilizzante (riboflavina allo 0,1% - destrano al 20%) oggi commercialmente denominata Ricrolin® prodotta da Sooft Italia è stata effettuata a partire da 10 minuti prima dell’inizio dell’ irraggiamento UVA.  Con il primo illuminatore UVA, ideato e sviluppato da Caporossi e Mazzotta sulla base di quello originale di Dresda (diWollensak, Seiler e Spoerl) e realizzato dalla ditta Exe-rion-Sas di Prato, costituito da 2 UVA-led 370-10, 750 microwatt x 2 (di Roithner Lasertechnic - Wien), munito di potenziometro regolatore per il voltaggio, abbiamo effettuato i primi 10 tratta-menti italiani di Cross-linking. Il controllo dell’energia erogata, prima e durante il trattamento, è stato effettuato mediante un UVA power-meter (Lasermate Q - di Coherent) dotato di apposita testata di    misurazione UVA. Per l’irraggiamento è stata impiegata la lunghezza d’onda di 370 nm (pari al picco massimale di assorbimento UVA della Riboflavina) ad 1,2 cm di distanza dalla cornea con una potenza di 3 Mw /cm2 di superficie pari ad una energia di 5,4 joule/cm2. Alla fine del trattamento i pazienti sono stati tutti medicati con antibiotico ad uso topico (Ofloxacina coll. x 4), midriatico(Ciclope-ntolato x 2) e bendaggio oculare con lente a contatto terapeutica morbida per quattro giorni. Le lenti a contatto terapeutiche sono state rimosse in tutti i pazienti in  quinta giornata dal tratta-mento. Sono stati effettuati successivamente i controlli oftalmologici   postoperatorie l’Analisi Micro-morfologica In vivo14,15 dell’epitelio corneale, dei plessi nervosi sub-basale, sub-epiteliale e stromale mediante microscopia confocale HRT II (Rostock Cornea Module - Heide-lberg - Ger-many) integrata da Cheratoestesiometria sec. Cochet-Bonnet) per la valutazione della sensibilità corneale, a 7 gg, 1 mese, 3 mesi, 6 mesi e 1 anno.   L’esame confocale è stato effettu-ato previa anestesia corneale topica (ossibruprocaina cloridrato coll.), gel corneale (metilcellu-losa)   con il microscopio confocale a scansione laser HRT II (Rostock Cornea Module) pre-ope-ratoriamente e a 7 gg 1, 3, 6 mesi e 1 anno dal trattamento. Si tratta del primo studio In vivo al mondo effettuato per tale metodica. Analisi Confocale dell’Epitelio Corneale e dei Plessi Nervosi La rigenerazione dell’epitelio corneale è stata regolare in tutti i pazienti trattati, nessun deficit epiteliale né ritardo di guarigione. L’epitelio, inizialmente sottile (10 micron), inizia a stratificarsi dal primo mese (20-30 micron) assumendo caratteristiche morfologiche più regolari ed omoge-nee del preoperatorio a tre-sei mesi (40-45 micron) contribuendo notevolmente al miglioramen- to visivo in virtù del suo effetto compensatorio e regolarizzante sulla superficie corneale. L’analisi confocale dei plessi nervosi tra 7 e 30 giorni dal trattamento ha dimostrato la totale sco-mparsa delle fibre nervose indotta dall’azione combinata Scraping-Riboflavina-UVA. La riboflavina concentra il 95% dell’energia UVA a livello sub-epiteliale e stromale anteriore con conseguente necrosi delle  fibre nervose nell’area centrale di 9 mm  sottoposta all’irradiazione UVA. L’inizio della rigenerazione nervosa sub-epiteliale si può collocare microscopicamente e cli-nicamente tra il primo e il secondo mese post-operatorio con la iniziale ripresa della sensibilità corneale.  Non sono invece apprezzabili modifiche  strutturali dei nervi nell’anello periferico non trattato oltre i 9 mm dal centro corneale evidenziandosi chiaramente una zona di transizio- ne laterale dimostrabile in tutti i pazienti analizzati. La rigenerazione delle fibre nervose è cara- tterizzata dalla comparsa di flocculazioni neuritiche sub-epiteliali nell’area centrale irradiata. Essa continua per tutto il periodo post-operatorio per completarsi nei mesi successivi restituendo normale sensibilità alla cornea. La metodica del cross-linking corneale riboflavina UVA determina la scomparsa delle fibre ner-vose sub-epiteliali nel primo periodo post-operatorio, fino al primo mese nell’area centrale tra-ttata per effetto della disepitelizzazione fino a 50 micron di profondità e per foto-necrosi UVA indotta nello stroma anteriore-intermedio fino tra 270 e 320 micron.Gli effetti citotossici del cro- sslinking sono significativamente alti e concentrati nella porzione anteriore della cornea per l’ele-vato assorbimento dei raggi UVA da parte della riboflavina (effetto barriera) che ne attenua l' assorbimento e il passaggio ai livelli  più profondi. Le fibre  nervose nell’anello periferico non trattato appaiono risparmiate con una zona di transizione ben evidenziabile microscopicamente. L’inizio della re-innervazione è collocabile, insieme alla ripresa della sensibilità corneale,a partire dal primo mese post-operatorio. Essa continua in tutto il periodo successivo per completarsi in-torno  al sesto mese con il ripristino della normale sensibilità tattile e dolorifica della cornea. Non sono evidenziabili fenomeni di alterazione della trasparenza e del trofismo dopo il trattame-nto correlati a meccanismi neuro-distrofici stromali da denervazione. La microscopia confocale HRT II ha consentito una precisa valutazione delle modifiche micro-morfologiche corneali in vivo dopo cross-linking del collagene corneale nei pazienti affetti da cheratocono entrando a pieno titolo nella ricerca di base ed avanzata per la validazione di questa metodica. Normale rigenerazione dell’epitelio corneale dopo crosslinking corneale Rigenerazione dei plessi nervosi dopo cross-linking corneale Studio dello stroma corneale e dell'endotelio Gli studi pre-clinici ex vivo ed in vivo su modello animale hanno dimostrato che Il cross-linking in-duce l’aumento dei legami interfibrillari, del diametro delle fibre collagene nello stroma corne-ale anteriore e intermedio a circa 300 micron di  profondità con i parametri utilizzati senza alcun danno per l’endotelio11 grazie all’effetto concentrante della riboflavina (agente fotosensibilizza- nte e fotoattenuante). Inoltre vi è un importante incremento della resistenza all’azione litica della pepsina per un enhancement dell’attività anticollagenasica corneale. Istologicamente dopo il tra-ttamento è stato dimostrato “ex vivo” un aumento del diametro delle fibre collagene, una maggi- ore resistenza alla lisi enzimatica (effetto anti-collagenasico), la scomparsa (per apoptosi e ne-crosi foto-indotta) dei cheratociti dello stroma anteriore ed intermedio seguita dal graduale ripo-polamento da parte dei cheratociti profondi ed una migliore ristrutturazione del collagene. Abbiamo ritenuto indispensabile dimostrare le modifiche tissutali direttamente in vivo nell’uomo mediante la microscopia confocale per contribuire a validare la metodica in termini di sicurezza. (Premio SOI 2004: migliore ricerca scientifica in Oftalmologia). Eccetto un edema corneale transitorio e la sensazione di corpo estraneo per 24-48 ore associata a bruciore oculare e lacrimazione fino al completamento della riepitelizzazione, sovrapponibili al post-operatorio di una chirurgia fotorefrattiva per i principali difetti di vista, non abbiamo osser-vato allo stato attuale effetti collaterali clinicamente evidenti sul segmento anteriore eccetto un haze transitorio che ha risposto bene al trattamento con steroidi topici (desametasone coll. mon-odose), Nessun segno di endoteliopatia, deficit epiteliali persistenti, cataratta, glaucoma o altro, né sul segmento posteriore dove l’esame retinico mediante OCT da noi effettuato non ha rilevato alterazioni retiniche al polo posteriore dell’occhio. Inoltre il trattamento non esclude la possibilità di effettuare una  cheratoplastica convenzionale né sembra indurre alterazioni della tollerabilità alle lenti a contatto che risulta indipendente. Gli studi confocali in  vivo da noi effettuati dimostra-no, dopo cross-linking   corneale Riboflavina-UVA ad 1, 3 e 6 mesi ed 2 anni, ad una profondità compresa  tra 40 e 350   µ la rarefazione dei cheratociti dello stroma anteriore-intermedio fino a  270-320  micron (linea di  demarcazione o zona di  transizione verticale), asso-ciata a marcato edema lacunare (il tessuto corneale assume un aspetto che noi definiamo di tipo  “spongioso” o  “a nido d’ape”. I cheratociti non sono evidenziabili a partire sin dallo strato sub-epiteliale fino a 350 micron. Al secondo mese è  osservabile la iniziale riduzione dell’edema che tuttavia persiste confocalmente anche per 3-4 mesi ed un incremento della densità stromale anteriore-intermedia con qualche fibra nervosa rigenerante. Dal terzo  mese in poi si comincia a intravedere qualche cheratocita attivato segno di iniziale ripopolamento dello stroma anteriore, tuttavia occorre aspe-ttare il sesto mese per rilevare una densa cellularità stromale composta da cheratociti attivati, fibre nervose rigenerate, aumento della densità tissutale (stroma iso e iperdenso) con netta ri-duzione dell’edema lacunare . Nell’area laterale oltre i 9 mm non irradiata i cheratociti conserva-no un aspetto normale con minima diffusione dell’edema. Questo studio ha dimostrato per la prima volta in vivo nell’uomo mediante microscopia confoca- le HRT II che gli effetti citotossici del cross-linking del collagenecorneale applicato al trattamento conservativo del cheratocono evolutivo sono significativamente alti ma concentrati nei 300 micron di profondità stromale con i parametri e i dosaggi da noi utilizzati13 in base ai dati raccomandati in letteratura da Wollensak e coll.  In particolare la microscopia confocale in real time in vivo co-nsente di rilevare una necrosi diffusa dei cheratociti nello stroma corneale anteriore ed interme-dio nell’immediato post-operatorio. Tale quadro è associato alla presenza di un cospicuo edema stromale che assume caratteristiche di tipo spugnoso o “a nido d’ape”. L’edema tende a persistere a lungo nel post operatorio riducendosi progressivamente nei primi tre mesi. Abbiamo osservato la presenza di una fitta trama fibrillare di aspetto “trabecolare” in cui è possibile scorgere, mascherati in parte dall’edema, la presenza di corpi cellulari “fantasma” e “puntiformi” iperiflettenti, verosimilmente di natura apo-ptotica (corpi apoptotici) e di nuclei più densi e allungati probabili residui necrotici dei cheratoci- ti. Questo studio dimostra l’effettivo ripopolamento stromale da parte dei cheratociti degli strati più profondi a partire tra il secondo e il terzo mese post-operatorio con la  ricomparsa di nuclei cellulari attivati in tuttigli  strati stromali  intermedi ed anteriori. A sei mesi di distanza dal tratta-mento il ripopolamento stromale appare pressoché completo. Nella nostra analisi micro-morfo-logica  abbiamo  inoltre evidenziato aspetti   particolari tra i quali un aumento della densità della matrice extracellulare stromale a partire dal secondo-terzo mese postope-ratorio, segno indire- tto di collagene cross-linkato che clinicamente non influenza negativamente le capacità visive di questi pazienti . Al contrario i rari casi di haze transitorio   hanno fatto rilevare caratteristiche ti-ssutali predittive in tre situazioni confocalmente identificabili preoperato-riamente: pazienti giova-ni sotto i 20 anni con aumento della densità cheratocitica e dei cherato-coti attivati nello stroma intermedio-anteriore, la presenza di strie scure (dark microstrie) a pattern reticolareointrecciate, la presenza di strie di Vogt marcate alla biomicroscopia. Queste caratteristiche si correlano con lo sviluppo potenziale di haze e ci permettono di adeguare da subito il protocollo terapeutico postoperatorio   iniziando un trattamento steroideo topico fin  da subito o in estrema analisi esc-ludendo tali soggetti dalla terapia e in ogni  caso di informare beneil paziente sul rischio individu-ale.La microscopia confocale HRT II ci ha consentito di dimostrare una chiara zona di transizio- ne verticale e laterale caratterizzate da una modesta diffusione dell’edemae dalla presenza di cellule regolarmente rappresentate sia nella zona corneale periferica non sottoposta ad irra-diazione, sia ad una profondità maggiore di 350 micron (tra 275 e 350 micron). Questo dato rappresenta la dimostrazione in vivo della effettiva penetrazione del trattamento ne-ll’uomo per la prima volta  al mondo con i parametri standardizzati. Infatti lo stroma corneale profondo non subisce modificazioni tissutali oltre i 350 micron né sono apprezzabili variazioni nella densità e nella morfologia dell’endotelio fino ad oggi. I risultati ottenuti con l’analisi micro-morfologica in vivo mediante microscopia confocale a scan-sione laser consentono ad oggi di poter considerare il cross-linking del cheratocono median- te Riboflavina-UVA una metodica sicura e promettente per il trattamento del cheratocono evolu- tivo al fine di ritardare e possibilmente evitare il ricorso al trapianto corneale. La microscopia confocale a scansione laser risulta un’indagine diagnostica molto più sensibile e specifica della biomicroscopia per l’inclusione dei pazienti affetti da cheratocono progressivo in questo trattamento. Lo studio confocale in vivo sui primi casi da noi trattati in Italia a Siena di-mostra, come sopra già sottolineato, che a partire dal sesto mese post operatorio fino a 2 anni di follow-up medio si assiste ad un incremento della densità della matrice extracellulare nello stroma anteriore ed intermedio. Lo stroma profondo conserva invece una normale refletti- vità . L’aumentata reflettività che a nostro avviso rappresenta in vivo il segno indiretto più im-portante di una cornea cross-linkata, è indice di una neosintesi di collagene ben strutturato a partire da cheratociti provenienti dagli strati corneali più profondi dopo il killing cellulare iniziale. L’espressione di un collageneben strutturato e la bonifica cellulare dello stroma anteriore inter-medio potrebbero spiegare la stabilità di questo promettente trattamento da noi rilevata fino ad oggi.Certamente occorrono studi più a lungo termine anche sul piano dell’analisi tissutale, attualmente in fase avanzata di valutazione ed approfondimento presso il nostro Dipartimento.  Per Prenotare una visita e per i dettagli tecnici pregasi contattare: il Dott. Cosimo Mazzotta

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